La secuenciación consiste en averiguar el orden sucesivo de los nucleótidos que lo componen.

En principio, basta con averiguar ese orden en una de sus 2 cadenas, ya que el orden de la otra queda fijado por la primera por la complementariedad de los nucleótidos de ambas.

La técnica, básicamente es la de “obtener” una cualquiera de las 2 cadenas y, sobre ella,  ir construyendo la otra sirviendose de ésta como molde. Al mismo tiempo es necesario conocer, mediante algún tipo de “artilugio técnico”, que nucleótido concreto, paso a paso, va formando esa otra cadena.

1.- Empezamos por la obtención de una de las cadenas:

Separar ambas cadenas del ADN a secuenciar y elegir una de ellas. Este proceso puede realizarse mediante una PCR asimétrica (*) de la que se obtendrán muchísimas copias de una sola de las cadenas del ADN que actuará como molde para que, sobre ella , vaya construyéndose la complementaria paso a paso.

(*) PCR asimétrica: se consigue básicamente con una diferente concentración de secuencias cebadoras de un lado y otro de la secuencia a replicar. Al agotarse el cebador de un lado, el otro sigue realizando sus ciclos pero, logicamente, sólo replica una cadena. La otra no puede hacerlo al no tener cebador que inicie su replicación.

2.- Una vez obtenida una de las cadenas del ADN. Formación de la otra cadena

–Debemos proporcionar un «colocador» de nucleótidos para que pueda elegir el nucleótido concreto y correcto que a cada paso debe colocarse. Esto no lo hacemos nosotros, sino la propia naturaleza. Para esto no hay sino añadir a la mezcla un enzima natural: ADN polimerasa. Ella es quien determina el nucleótido a colocar entre todos los posibles ya que se fija en el molde, lo reconoce, elige y coloca enfrentado al que corresponda.

-Para realizar lo anteriormente expuesto debemos añadir los materiales necesarios para la elaboración de la otra: Es decir, proporcionar  todos los nucleótidos sueltos posibles para formar la cadena complementaria. Éstos se obtienen en laboratorios que los proporcionan. Por otro lado, estos nucleótidos deben poseer algún “truco” para diferenciarlos cuando se vayan colocando; es decir, cuando hayan enlazado en la cadena que van formando. Esto se logra, habitualmente, con fluorocromos  de colores diferentes enlazados a los nucleótidos y según cada tipo de nucleótido, que se “iluminan” de su color correspondiente al acoplarse y, por tanto, poder ser captada su señal luminosa específica..

3.- Detectar el orden de nuclótidos sucesivamente colocado

-Una fuente “laser” concreta detecta y excita el fluorocromo asociado por su color a cada paso enviando al ordenador una señal que se corresponde, por el color de la señal emitida, al nucleótido concreto colocado. Lo envía a un ordenador de forma sucesiva. El ordenador recoge dicha información que luego traducirá a secuencia de nucleótidos por el orden de colocación.

Así queda la secuencia de una de las cadenas del ADN original habiendo utilizado su proceso de formación.

El orden de nucleótidos de la otra cadena -la que se utilizó como molde, ignorándose inicialmente su secuencia- queda determinado por la secuencia de la formada. Así queda secuenciado el ADN en sus cadenas.

Nota:

Esta técnica no es del todo satisfactoria para cadenas de ADN muy largas ya que la ADN polimerasa parece que se “cansa” y de tanto elegir y colocar puede cometer errores y poner nucleótidos que no se corresponden, además de otros condicionantes (controles técnicos físico-químicos, pH, temperatura, cantidades relativas de los diferentes nucleótidos, etc…) que también pueden provocarlos.

Superar el inconveniente anterior

Para realizar la secuenciación en ADNs largos, previamente se “parte” en trozos la cadena molde una vez obtenida y se secuencia cada trozo separadamente.

No obstante, esto tiene un inconveniente: ¿qué trozo va a continuación de qué otro trozo para recomponer la secuencia total?. Es como tener las piezas de un puzzle pero sin posibilidad de encaje entre ellas.

Pues bien, este problema también tiene su solución: realizar otro puzzle con la misma cadena (romperla por otros sitios diferentes a la partición anterior) y así, comparando la secuencia de  los fragmentos de una y otra partición, observaremos zonas comunes entre ellas (secuencias comunes que encajan)  que nos  servirán para alinearlas en el orden final correcto.

 

Actualmente existen otros «artilugios técnicos» que permiten obtener también secuenciaciones de ADN, aunque su principio básicamente se fundamente en lo mismo que hemos expuesto.