12
diciembre

Obtención del ADN (III)

Después de extraídos, los ácidos nucleicos deben conservarse de una forma adecuada. El ovillo de ADN obtenido con la varilla se disuelve en una solución amortiguadora en frío (4º C). No puede congelarse ya que los cristales de hielo al formarse y descongelarse producen fuerzas cizallantes que lo romperían. El ARN, al ser de cadena sencilla, si puede conservarse congelado en disolución acuosa al que hay que añadir un inhibidor de las ribonucleasas.

La separación de ARN-ADN o de sus diferentes tipos, o de fragmentos diferentes del ADN acostumbra a realizarse o bien por centrifugación (separación por la densidad) que puede realizarse en 2 modalidades: centrifugación zonal o isopícrica,  o por electroforesis. La centrifugación zonal, por ejemplo es muy utilizada para separar las diferentes fracciones del ARN ribosómico. La Isopícrica o  de equilibrio de sedimentación en la que la centrifugación produce un gradiente de densidad (habitualmente se utiliza una disolución de cloruro de Cesio) que separa los componentes es utilizada para la separación del ADN genómico fragmentado en que  se separan en bandas las diferentes bandas satélites de la banda principal en función del contenido (G+C) de las mismas.

La electroforesis se basa en la capacidad de las moléculas con carga para desplazarse en un campo eléctrico. Las moléculas de ADN a pH neutro o alcalino tienen carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que hace que su mayor o menor desplazamiento al polo positivo sólo esté determinado por su tamaño. Las pequeñas avanzan más y las más grandes avanzan poco. De este modo pueden separarse diferentes fragmentos de ADN, formando sobre el soporte el clásico código de barras que caracteriza esta técnica. Hay que indicar que el ADN, inicialmente no visible, se pone de manifiesto a través de la flourescencia de ciertos compuestos intercalantes que se unen a ellas; siendo el más tradicional de ellos el bromuro de etidio.

El inconveniente de esta técnica es su incapacidad de resolver (separar) fragmentos grandes de ADN. Hasta 50 Kb. Los fragmentos de mayor tamaño aparecerían mezclados en el gel en la misma posición formando una sola marca. Para ampliar su resolución se utiliza una derivación de la técnica: electroforesis de campo pulsante,  que consiste en alterar periódicamente la orientación del campo eléctrico aplicado. Con ello se consiguen resoluciones de varias megabases.

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