Monthly Archives: diciembre 2020

12
diciembre

Un problema de genética molecular (sencillamente complicado)

Imagínese Vd. un microorganismo con un genoma haploide (ADN) cuyo tamaño es de solamente 16 pares de base; y además siempre contienen 8 pares A-T y 8 pares G-C.  ¿Podría calcular usted  el número de genomas diferentes posibles en esa especie de microorganismo?.

La solución, siempre razonada, puede enviarla a través del propio post o dirigirla a gerardo (arroba) dnadidactic.com. El plazo es de un mes a partir de la fecha de publicación del post.

A los acertantes les enviaremos un PDF sobre una pequeña unidad  para construir con materiales sencillos una maqueta de ADN  que incluye, además,  algunas actividades para conocer más el ADN.

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12
diciembre

Obtención del ADN (IV)

Otras técnicas desarrolladas más recientemente permiten estudiar el ADN sin necesidad de manipulación alguna, salvo la lisis de las células. Se habla de técnicas de extracción directa de ADN ya que no requieren tanta manipulación previa y en un solo proceso permiten obtener ADN.

La mayoría de estos métodos se basan en la adsorción selectiva sobre soportes “ad hoc”. El proceso básicamente consiste en realizar el lisado celular en el mismo lugar en el que se encuentra en material adsorbente dispuesto en forma lineal o columna. Se fuerza el paso de la disolución lisada por la columna, bien por presión o por centrifugación, de este modo irán saliendo eliminados los materiales no adsorbidos. Se lava con una disolución tampón para eliminar posibles materiales adheridos no deseados; y por último se añade un disolvente para desprender el ADN adsorbido al soporte. Parece que queda claro que el “quid” de este método es dar con el material adecuado para actuar como soporte.

Una aplicación específica de este método es el de las tarjetas FTA (marca registrada)que consisten en papel especialmente tratado que permite adsorber una muestra, normalmente sangre, lisar las células, desnaturalizar proteínas y proteger el ADN que queda intacto en el papel (todo en uno). Incluso pueden conservarse durante tiempo e, incluso, pueden ser enviadas por correo.

Otro de los métodos que podemos calificar de extracción directa es el uso de microesferas magnéticas, sobre cuya superficie se fija el ADN, bien directamente o por la acción de otras moléculas con afinidad al ADN fijadas previamente en las microesferas. Un imán retendrá las microesferas con el ADN; posteriormente se procede a la separación de ambos.

El uso de microesferas magnéticas es muy utilizado para estudios de expresión genica para detectar los ARNm en células eucariotas. Estos ARN tienen la peculiaridad de dotarse al término de su transcripción  de una cola en su extremo 3´ con una larga fila de ribonucleótidos de Adenina (cola poli A) para protegerse del ataque de las ribonucleasas nucleares en su traslado al citoplasma. Basándose en dicha propiedad, se preparan las microesferas dotándolas de un   polinucleótido (poli T), anclándolos a ellas lógicamente por su extremo 5´, donde los ARNm quedarán fijados por complementariedad.

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12
diciembre

Obtención del ADN (III)

Después de extraídos, los ácidos nucleicos deben conservarse de una forma adecuada. El ovillo de ADN obtenido con la varilla se disuelve en una solución amortiguadora en frío (4º C). No puede congelarse ya que los cristales de hielo al formarse y descongelarse producen fuerzas cizallantes que lo romperían. El ARN, al ser de cadena sencilla, si puede conservarse congelado en disolución acuosa al que hay que añadir un inhibidor de las ribonucleasas.

La separación de ARN-ADN o de sus diferentes tipos, o de fragmentos diferentes del ADN acostumbra a realizarse o bien por centrifugación (separación por la densidad) que puede realizarse en 2 modalidades: centrifugación zonal o isopícrica,  o por electroforesis. La centrifugación zonal, por ejemplo es muy utilizada para separar las diferentes fracciones del ARN ribosómico. La Isopícrica o  de equilibrio de sedimentación en la que la centrifugación produce un gradiente de densidad (habitualmente se utiliza una disolución de cloruro de Cesio) que separa los componentes es utilizada para la separación del ADN genómico fragmentado en que  se separan en bandas las diferentes bandas satélites de la banda principal en función del contenido (G+C) de las mismas.

La electroforesis se basa en la capacidad de las moléculas con carga para desplazarse en un campo eléctrico. Las moléculas de ADN a pH neutro o alcalino tienen carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que hace que su mayor o menor desplazamiento al polo positivo sólo esté determinado por su tamaño. Las pequeñas avanzan más y las más grandes avanzan poco. De este modo pueden separarse diferentes fragmentos de ADN, formando sobre el soporte el clásico código de barras que caracteriza esta técnica. Hay que indicar que el ADN, inicialmente no visible, se pone de manifiesto a través de la flourescencia de ciertos compuestos intercalantes que se unen a ellas; siendo el más tradicional de ellos el bromuro de etidio.

El inconveniente de esta técnica es su incapacidad de resolver (separar) fragmentos grandes de ADN. Hasta 50 Kb. Los fragmentos de mayor tamaño aparecerían mezclados en el gel en la misma posición formando una sola marca. Para ampliar su resolución se utiliza una derivación de la técnica: electroforesis de campo pulsante,  que consiste en alterar periódicamente la orientación del campo eléctrico aplicado. Con ello se consiguen resoluciones de varias megabases.

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12
diciembre

Obtención del ADN (II)

Obtenida la población celular de las que queremos obtener su ADN toca ahora liberarlo del o de los recintos donde se encuentra.

El proceso comienza con la lisis celular (romperlas/deshacerlas). Requiere la ruptura de la membrana: basta con utilizar un medio hipotónico (la ósmosis revienta la célula). Al medio, se acostumbra a añadirle detergentes para solubilizar los lípidos y algún inhibidor de las nucleasas (enzimas rompedoras de ácidos nucleicos) para no dañarlos. En ocasiones también se añaden también sustancias que eliminen ya de entrada otras moléculas.

Posteriormente se realiza la obtención de las fracciones subcelulares normalmente por centrifugación diferencial: velocidades y tiempos crecientes. Los diferentes orgánulos se irán al sedimento del  fondo en función de su densidad. Inicialmente restos de células, núcleos y citoesqueleto; a más revoluciones y tiempo: mitocondrias, lisosomas y peroxisomas,…..pequeñas vesículas y microsomas,……ribosomas y grandes macromoléculas.

Para la obtención de ADN  y/o ARN existen una gran variedad de métodos, algunos a menudo ocultos bajo intereses comerciales y patentes. Con todo, un primer factor a considerar es la necesidad de separar y eliminar las demás biomoléculas que pudieran estar presentes en la muestra. Para ello, cualquier método debe basarse en las propiedades físico-químicas que hacen a los ácidos nucleicos y también entre ellos distintos de otras biomoléculas. Entre ellos cabe citar: degradación enzimática (uso de enzimas que rompen las moléculas indeseables respetando las que interesa): uso de proteasas, DNA-asas; RNA-asas o de inhibidores para evitar su acción. Uso de detergentes u otros productos (urea, cloruro de guanidinio,..) para desnaturalizar proteínas y retirarlas por precipitación.

La acción diferencial en medio alcalino del ADN con respecto al ARN: El ARN se hidroliza (se rompe), mientras que el ADN sólo se desnaturaliza pudiendo renaturalizarse posteriormente. Utilizar la diferencia en solubilidad entre el ADN, ARN y proteínas o la precipitación alcohólica por la escasa solubilidad en alcohol de los ácidos nucleicos.

El alcohol retira el agua que hidrata los grupos fosfato de los ácidos nucleicos y favorecen la unión de los cationes a los dichos grupos transformándose en moléculas neutras que pueden agregarse entre sí y precipitar. Esta maniobra acostumbra a ser la etapa final de la obtención del ADN ó ARN (que ya se habrían separado en una etapa anterior).

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12
diciembre

Obtención del ADN (I)

Cuando se trabaja con ADN es preciso obtenerlo aislado para poder manipularlo con más facilidad.

El ADN se encuentra las células eucariotas en el núcleo celular y en determinados orgánulos: mitocondrias (en todas las células) y cloroplastos (sólo vegetales).

Ordinariamente la muestra para trabajar se obtiene de algún trozo del ser vivo que contiene células de uno o varios tejidos. Debemos intentar “deshacer” todo aquello que no es ADN y, al mismo tiempo, que no le afecte a él: disociar el tejido, separar los tipos celulares, romper las membranas celulares (lisar las células), fraccionar los componentes celulares, separar los componentes químicos y, de entre ellos, buscar la estrategia para separar el ADN del resto.

1.-Para disociar los tejidos:

1.1.-Fragmentación mecánica: corte, troceado o triturado en disolución amortiguadora de pH

1.2.-Disgregación química: rotura de la matriz extracelular y uniones intercelulares normalmente con detergentes.

1.3.-Disgregación enzimática: digestión de las proteínas de la matriz (proteasas, colagenasas, pepsina, tripsina, etc)

2.- Para separar células:

2.1.-Centrifugación: La fuerza centrífuga mueve componentes según su densidad. Previamente esos componentes (mezcla celular) deben incorporarse a un medio líquido que permita su movilidad. También puede incorporarse un medio que en sí mismo forma un gradiente de densidad lo que facilita la separación. En ocasiones hay que realizar varias centrifugaciones para ir eliminando poco a poco las partes que no interesan que permite incluso separar finalmente subpoblaciones celulares (Elutriación centrífuga).

2.2.-Citofluorometría de flujo. Células a las que por afinidad se les ha añadido una etiqueta (fluorocromo) o etiquetas diferentes –según tipo celular- que son transportadas en suspensión por el fluir de un medio (una disolución salina isotónica). De este modo son detectadas por un analizador laser que las clasifica y  posteriomente las separa en función de la etiqueta.

2.3.-Afinidad magnética: Semejante al anterior.La etiqueta es una microesfera magnética asociada a una proteína afín al tipo celular al que se pegan. Posteriormente son separadas por imantación.

Existen variantes de cada uno de los métodos indicados, así como muchos otros más específicos: ensayos de exclusión, ensayos por incorporación de marcador, ensayos por medida de la función metabólica,…

Como ejemplo podemos citar la exclusión de células vivas o muertas por la incorporación o no, respectivamente, del colorante azul de triptano, diferenciables al microscopio.

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