Cuando se trabaja con ADN es preciso obtenerlo aislado para poder manipularlo con más facilidad.
El ADN se encuentra las células eucariotas en el núcleo celular y en determinados orgánulos: mitocondrias (en todas las células) y cloroplastos (sólo vegetales).
Ordinariamente la muestra para trabajar se obtiene de algún trozo del ser vivo que contiene células de uno o varios tejidos. Debemos intentar “deshacer” todo aquello que no es ADN y, al mismo tiempo, que no le afecte a él: disociar el tejido, separar los tipos celulares, romper las membranas celulares (lisar las células), fraccionar los componentes celulares, separar los componentes químicos y, de entre ellos, buscar la estrategia para separar el ADN del resto.
1.-Para disociar los tejidos:
1.1.-Fragmentación mecánica: corte, troceado o triturado en disolución amortiguadora de pH
1.2.-Disgregación química: rotura de la matriz extracelular y uniones intercelulares normalmente con detergentes.
1.3.-Disgregación enzimática: digestión de las proteínas de la matriz (proteasas, colagenasas, pepsina, tripsina, etc)
2.- Para separar células:
2.1.-Centrifugación: La fuerza centrífuga mueve componentes según su densidad. Previamente esos componentes (mezcla celular) deben incorporarse a un medio líquido que permita su movilidad. También puede incorporarse un medio que en sí mismo forma un gradiente de densidad lo que facilita la separación. En ocasiones hay que realizar varias centrifugaciones para ir eliminando poco a poco las partes que no interesan que permite incluso separar finalmente subpoblaciones celulares (Elutriación centrífuga).
2.2.-Citofluorometría de flujo. Células a las que por afinidad se les ha añadido una etiqueta (fluorocromo) o etiquetas diferentes –según tipo celular- que son transportadas en suspensión por el fluir de un medio (una disolución salina isotónica). De este modo son detectadas por un analizador laser que las clasifica y posteriomente las separa en función de la etiqueta.
2.3.-Afinidad magnética: Semejante al anterior.La etiqueta es una microesfera magnética asociada a una proteína afín al tipo celular al que se pegan. Posteriormente son separadas por imantación.
Existen variantes de cada uno de los métodos indicados, así como muchos otros más específicos: ensayos de exclusión, ensayos por incorporación de marcador, ensayos por medida de la función metabólica,…
Como ejemplo podemos citar la exclusión de células vivas o muertas por la incorporación o no, respectivamente, del colorante azul de triptano, diferenciables al microscopio.
