Cuantificar el ADN

16
mayo

Química y ADN (3)

Cuantificar el ADN.- 3

En el post anterior vimos cómo los científicos disponen de cantidades irrisoria de ADN para realizar sus investigaciones.

Una forma de obtener más cantidad de ADN, que al menos, nos haga disponer de cantidades mayores en varios rangos de magnitud (ng o incluso µg) es la técnica de la PCR (Polymerase Chain Replication), que viene a ser como una fotocopiadora de un fragmento de ADN produciendo varios miles de copias idénticas, incluso millones de las mismas. Esto eleva la cantidad 1 o 2 rangos más la magnitud de la cuantía. Aun así, se obtienen nanogramos o microgramos.

Volvemos con la misma pregunta: ¿Es posible que una balanza nos mida la cantidad de ADN en esas cantidades tan exiguas? Tampoco es posible. Entonces, ¿cómo cuantificamos el ADN que tenemos para trabajar? Vamos a ello.

El ADN tiene otra peculiaridad peculiar: su absorbancia específica. Esta propiedad significa que absorbe la luz (radiación electromagnética) en una determinada longitud de onda, la de 260 nm, una radiación concreta dentro de la franja del ultravioleta. Además, dicha absorbancia es proporcional a la cantidad de ADN presente. Tener un aparato –espectrofotómetro- que mida la absorbancia obtenida en una muestra con ADN, traduce  la cantidad de ADN presente. Así es como se cuantifica el ADN presente y es una forma indirecta de hacerlo.

Aunque no es lo mismo, como analogía, nos puede servir el ejemplo del café: sólo, más o menos cortado o con más o menos leche. Observando su color, podemos determinar la mayor o menor cantidad de café presente.

Los científicos han calibrado los espectrofotómetros con cantidades de ADN conocidas para servir como referencia a cualquier otra cantidad. Así es como conseguimos determinar las cantidades exactas (en unidades de masa) con las que se trabaja.

Absorbancia: La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra, basándose en la ley de Beer – Lambert.  Esta medición también puede usarse para medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia.

Ley de Beer – Lambert: A = – log10 I1 /I0 , siendo A la medida de la absorbancia, I1 la intensidad de la luz al salir  e I0 la intensidad de la misma al entrar.

El ADN tiene la peculiaridad de presentar absorbancia específica con un determinado tipo de luz uV a 260 nm de longitud de onda.

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15
mayo

Química y ADN (2)

Cuantificar el ADN .- 2

“MASAR” el ADN

En el post anterior decíamos que, para cuantificar ADN,  se trabaja habitualmente con su masa. ¿Cómo calcular su masa?. Con una balanza es imposible porque, aunque el ADN, es una molécula grandísima, aun juntando un nº grande de ellas, su masa sería tan insignificante que ni siquiera una balanza de precisión podría hacerlo. Debemos hacerlo indirectamente.

Veamos la razón de lo anteriormente expuesto  realizando un cálculo.

Empecemos por calcular la masa de una unidad de masa atómica (uma=Dalton). Nos servimos del concepto de mol, expuesto anteriormente.

1mol de Hidrogeno pesa 1 gramo y tiene 6,02 x1023 átomos y cada átomo tiene 1 uma (unidad de masa atómica). Por un sencillo cálculo,  1 sólo átomo de hidrógeno (1 uma) tendrá 1/6,02 x1023 gramos = 1/6,02 x 10 -23 g = 0,166 x 10-23 = 1,66 x 10-24 gramos. Esta cantidad es tan pequeña que deberíamos utilizar submúltiplos del gramo para manejarnos mejor:

Así, 1 uma=  1,66 x10-24 gramos = 1,66 x 10-21 mg = 1,66 x10 -18 μg = 1,66 x10-15 ng = 1,66 x 10 -12 pg = 1,66 x 10-9 fg

Como te decía: ¿A ver qué balanza pesa esa ridícula cantidad?

Bien pasemos ahora a calcular la masa del ADN nuclear de 1 célula humana. Sabemos que todo el ADN envasado en los 46 cromosomas humanos, tiene un total  6.000 millones de pares de nucleótidos, distribuidos heterogéneamente en los diferentes cromosomas. De los pares de nucleótidos sí que sabemos su masa molecular ya que podemos sumar  la masa atómica de todos los átomos que los conforman con sólo mirar sus fórmulas e ir contando. Cada para de nucleótidos A-T y G-C nos da una cifra similar que podemos igualar en 630. (630 umas).

Por tanto el ADN de una célula humana tiene una masa de : 1,66 x 10-24 g x 630 x 6.000.000.000 (6 x 109) = 6.274,8 x 10-15= 6,275 x 10-12 g = 6,27 pg.

Tampoco podríamos pesar una cantidad tan insignificante ni con la mejor balanza de precisión.

Veamos ahora con cuantas células humanas tendríamos que hacernos para  obtener una cantidad significativa (digamos 1 gramo) de ADN.

Si  el ADN de una célula tiene 6,27 pg, el nº de células para hacer 1 g de ADN sería = 1g/6,27pg/célula= 1 x 1012 pg /6,27 pg/célula = 0,16 x 1012 células = 1,6 x1011 células = 160.000.000.000 (ciento sesenta mil millones) de células. Como dicen los andaluces: ¡una jartá dellas!.

Ahora incluso podemos calcular la cantidad de ADN que contiene el cuerpo humano completo ya que, según estimaciones más verosímiles, su número asciende a 30 billones (30.000.000.000.000 = 3 x 1013 células). Los gramos de ADN del cuerpo humano = 3×1013 células / 1,6 x1011 células/gramo = 1,87 x 102 g = 187 g (*)

(*) Otros cálculos estiman en 37 billones el nº de células del cuerpo humano. Por tanto 3,7×1013 /1,6×1011 celulas/gramo= 2,31 x102 g = 231 g

Con todos estos datos podemos hacernos una idea de la escasa cantidad de ADN con la que los científicos tienen que trabajar cuando, por ejemplo, extraen una muestra de tejido sanguíneo para obtener  el ADN de los glóbulos blancos, o cuando se extrae una muestra de semen o un frotis de la mucosa bucal: escasos picogramos y, en el mejor de los casos, nanogramos.

Surge de nuevo la pregunta: ¿Cómo averiguar la cantidad en masa del ADN obtenido si no existe balanza de precisión que alcance tales magnitudes?.  La respuesta en el próximo post.

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14
mayo

Química y ADN (1)

Cuantificar el ADN.- 1

El Mol y el ADN

 

El  “Mol”; esa palabreja que pone los pelos de punta al estudiante cuando se la encuentra en alguno de esos problemas de química. No obstante, para trabajar químicamente con las sustancias químicas y conocer sus cantidades, los moles con sus múltiplos y submúltiplos, son imprescindibles, ya que son una forma de cuantificar la sustancia con la que se trabaja.

Todos sabemos lo que es un par, un trío, un cuarteto, una decena, una docena, una centena, etc. Todas estas palabras se refieren a una cantidad de unidades iguales: 2, 3, 4, 10, 12, 100, respectivamente. El “mol” pertenece a ese tipo de palabras que también expresan una cantidad de unidades iguales, pero en este caso  una cantidad enorme: 602.000 trillones. Por tanto 602.000 trillones de cosas iguales hacen 1 mol de esas cosas.  Los científicos ponen esa cantidad en potencias de 10 y así, 602.000.000.000.000.000.000.000 = 6,02 x 1023.

¿Por qué esa cantidad y no otra?. La razón es que para conseguir 1 gramo de átomos de hidrógeno (H=masa atómica 1 unidad de masa atómica) es necesario juntar un mol (6,02 x1023) de esos átomos.  Y lo mismo para cualquier otro elemento químico. Se necesita esa  misma cantidad de átomos para conseguir los gramos determinados por su masa atómica. Ejemplo: el Carbono (C)  tiene una masa atómica de 12 (es 12 veces más másico que el Hidrógeno) lo que significa que para obtener 1 mol de átomos de carbono tendríamos que juntar 6,02 x1023 átomos de carbono cuya masa total sería de 12 gramos. El mol es siempre la misma cantidad, pero la masa de 1 mol depende de qué cosas estamos hablando. Lo mismo que una docena de huevos no tiene la misma masa que una docena de melones.

Lo mismo sucede con aquellas sustancias químicas cuyas moléculas están formadas por una agrupación de átomos. Por ejemplo, el Agua (H2O) cuya masa –en este caso molecular- es de 18 (16 por el átomo de Oxígeno y 2 por los 2 átomos de hidrógeno que la forman). 1 mol de agua tendría una masa de 18 gramos y contendría 6,02 x 1023 moléculas de agua.

El ADN también es una sustancia química, pero tiene una peculiaridad peculiar: Es muy larga, pero  puede ser más larga  o más corta (mayor o menor masa molecular), según de qué ADN estemos hablando y, además, normalmente, cuando en el laboratorio se trabaja con el ADN se acostumbra a trocearlo en multitud de fragmentos heterogéneos de diferente longitud y, por tanto de diferente masa,, y por tanto, no se obtienen moléculas iguales. Así no podemos medirlo en moles, ya que para ello sería necesario que los fragmentos fuesen iguales. Recuerda que en  el mol  se cuentan cosas iguales. Sólo sería posible hablar de moles cuando los fragmentos de ADN fuesen iguales,  o cuantificando los componentes básicos del ADN (A,T,G,C) o sus pares  (A-T) y  (G-C).

Por esa razón, en los laboratorios donde se trabaja el ADN las cifras para su cuantificación de dan en unidades de masa y no de moles. ¿Y cómo “masar” el ADN?. Pista en el próximo post.

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